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蛋白質(zhì)提取過程中常用蛋白酶和磷酸酶抑制介紹
  • 發(fā)布日期:2016-04-01     信息來源:      瀏覽次數(shù):3597
    • 在與蛋白相關的檢測中,zui關鍵的一步便是蛋白質(zhì)的提取。在提取的過程中,我們要經(jīng)常加入蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)的降解。另外在磷酸化蛋白的研究過程中,磷酸酶抑制劑也是*的。
       
             本文詳細總結(jié)了常用的蛋白酶抑制劑PMSF、Leupeptin亮肽素、Aprotinin抑肽酶、Pepstatin胃蛋白酶抑制劑、EDTA-Na2等以及磷酸酶抑制劑NaF氟化鈉、Na3VO4原礬酸鈉、Beta-glycerophosphate甘油磷酸鈉、Na2P2O4焦磷酸鈉等的溶液配制、貯存液與工作液濃度及保存條件。

      一、蛋白酶抑制劑
      PMSF:
      特性:絲氨酸蛋白酶抑制劑,如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶和凝血酶,也抑制半胱氨酸蛋白酶如木瓜蛋白酶。 
      溶解性:溶于異丙醇、乙醇、甲醇和丙二醇里>10mg/ml。在水溶液中不穩(wěn)定。在100%異丙醇,25℃時穩(wěn)定至少9個月。
      分子量:174.2
      使用:貯存濃度200mM,工作濃度1mM
       
      Leupeptin 亮肽素
      特性:抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶如胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、纖溶酶和組織蛋白酶B。
      溶解性:高度溶于水(1mg/ml)。4℃一周穩(wěn)定,分成小份,冷凍在-20℃至少6個月。
      分子量:C20H38N6O4 ×1/2 H2SO4:475.6  C20H38N6O4 x 1/2 H2SO4 × H2O:493.6
      使用:貯存濃度1mg/ml,工作濃度0.5 ug/ml (1mM)。
       
      Aprotinin抑肽酶
      特性:絲氨酸蛋白酶抑制劑,抑制纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶的高活性。不抑制凝血酶或因子X。
      溶解性:易溶于水(10mg/ml)或緩沖液(例如0.1M tris,pH8.0)。pH約7~8的溶液在4℃可保存1周,分裝保存在-20℃可至少保存6個月。避免反復凍融, pH>12.8的堿性環(huán)境可使其滅活。
      分子量:6,512
      使用:貯存濃度1mg/ml,工作濃度0.06~2.0 ug/ml(0.01~0.3 uM)。
       
      Pepstatin胃蛋白酶抑制劑
      特性:抑制天冬氨酸(酸)蛋白酶如胃蛋白酶、腎素、組織蛋白酶D、凝乳酶、許多微生物酸性蛋白酶
      溶解性:溶于甲醇約1mg/ml; 可溶于乙醇,第二天溶解可達到1 mg/ml;在6當量乙酸中溶解度為300ug/ml。4℃穩(wěn)定一周,分裝儲存于-20℃時可保存1個月。
      分子量:685.9
      使用:貯存濃度1mg/ml,使用濃度0.7 μg/ml(1 μM)。
       
      EDTA-Na2
      特性:金屬蛋白酶抑制劑
      溶解性:溶于水至0.5M,在pH8-9的條件下,4℃穩(wěn)定至少6個月
      分子量:372.24
      使用:工作濃度0.2~0.5 mg/ml(0.5~1.3 mM),不需現(xiàn)用現(xiàn)配,在溶液pH值調(diào)至8~9時再加入。
       
      二、磷酸酶抑制劑
      NaF氟化鈉 
      溶解性:溶于水
      分子量:41.99
      使用:貯存液5M,工作濃度10~20mM。
       
      Na3VO4 原礬酸鈉 
      分子量:183.91
      溶解性:溶于水,我們購買過來的是原礬酸鈉。原礬酸鈉需要經(jīng)過處理以后才能成為激活的礬酸鈉,激活的礬酸鈉才具有抑制去磷酸化的作用。原礬酸鈉變成激活的礬酸鈉的過程是:100mM原礬酸鈉激活儲存液配制
      (1). 取0.183克的原礬酸鈉溶解于10ml的雙蒸水中,加酸調(diào)節(jié)PH至10(顏色變黃)。
      (2). 煮至無色
      (3). 室溫冷卻
      (4). 重調(diào)pH至10
      (5). 重復(1)(2)(3)(4)直至溶液保持無色,并且pH穩(wěn)定于10,分裝100ul/管,每10ml裂解液加一管。
      使用:貯存液100mM, 工作濃度1mM,-20度保存。
       
      Beta-glycerophosphate 甘油磷酸鈉
      溶解性:溶于水
      分子量:306.11
      使用:貯存液100mM,工作濃度25mM。
       
      Na2P2O4 焦磷酸鈉
      溶解性:溶于水
      分子量:265.9

      使用:貯存液100mM,工作濃度1-2 mM。

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