那么下面上海嘉鵬科技有限公司為大家簡(jiǎn)單介紹一下關(guān)于蛋白質(zhì)純化方法經(jīng)典攻略（三）：
離子交換層析
離子交換層析分離蛋白的原理是基于其凈電荷的不同，通過蛋白質(zhì)與帶電荷的固定相之間的靜電作用力進(jìn)行分離。
IEX有以下兩類: （1）陰離子交換層析 （固定相帶正電荷，與帶負(fù)電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）；（2）陽離子交換層析（固定相帶負(fù)電，與帶正電的蛋白質(zhì)相結(jié)合）。離子交換層析常用于蛋白質(zhì)純化工藝中期。但是，對(duì)某些蛋白，在純化工藝的前期或后期采用該方法亦可獲得良好的分離效果。
圖 5. 蛋白質(zhì)凈電荷受其溶劑pH值影響。
當(dāng)pH=pI時(shí)，蛋白質(zhì)凈電荷為0，因此既不與陰離子交換的固定相也不與陽離子交換的固定相相結(jié)合。調(diào)節(jié)pH值高于或低于pI值可使蛋白質(zhì)帶上凈電荷，使其與陰離子交換樹脂（pH > pI）的固定相或者陽離子交換（pH < pI）的固定相相結(jié)合。
由于氨基酸的基本結(jié)構(gòu)和與其共價(jià)結(jié)合的修飾成分的影響，所有的蛋白質(zhì)都會(huì)帶有凈電荷。由于溶劑可以與蛋白質(zhì)相互交換氫離子，因此蛋白質(zhì)的凈電荷受其溶劑pH值的影響。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）是蛋白質(zhì)不帶電時(shí)的pH值。當(dāng)pH值高于pI時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)帶負(fù)電，而當(dāng)pH值低于pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電。因此，可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來控制結(jié)合蛋白是與離子交換柱結(jié)合或是從柱上洗脫。
理論上來說，只要緩沖液pH值調(diào)節(jié)合適，所有的蛋白質(zhì)都可以與陽離子交換柱和陰離子交換柱結(jié)合。但是，蛋白質(zhì)純化過程中，選擇純化條件和層析柱類型時(shí)*重要的考慮因素就是要保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。因此，選擇哪一種離子交換層析和選擇什么樣的條件會(huì)影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和活性是必須要考量的。通常，一些與某類離子交換層析相結(jié)合的條件可能對(duì)某種蛋白質(zhì)比對(duì)其他蛋白質(zhì)更為合適。
了解蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的知識(shí)可幫助尋找*合適的離子交換層析方法。以下在線工具可計(jì)算一個(gè)蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn) EXPASY。這些計(jì)算都*基于蛋白質(zhì)的氨基酸序列，不考慮其三維空間結(jié)構(gòu)。而在實(shí)際情況中，一個(gè)蛋白質(zhì)的某些殘基可能暴露得比其他部分更多，所以，其實(shí)際pI和表面凈電荷某些時(shí)候可能與理論計(jì)算值不盡相符 。氨基酸的相對(duì)位置分布同樣會(huì)影響一個(gè)蛋白質(zhì)的pI值 ，而這一點(diǎn)在理論計(jì)算時(shí)同樣未予考慮。有些技術(shù)可通過實(shí)驗(yàn)方法測(cè)得蛋白質(zhì)實(shí)際的pI值，如等電聚焦電泳 、等電聚焦毛細(xì)管電泳 和高通量光學(xué)測(cè)量法等 。
蛋白質(zhì)與IEX的結(jié)合必須采用較寬pH值范圍的溶液進(jìn)行多次嘗試以獲得*合適的蛋白質(zhì)保留pH值。在pI值左右1個(gè)pH單位的溶液pH值通常認(rèn)為是較合適的蛋白質(zhì)結(jié)合pH值。但是，在有些情況下，也可能需要在遠(yuǎn)離pI值的pH值條件下進(jìn)行 。
圖 6. 離子交換層析。
蛋白質(zhì)在低離子強(qiáng)度條件下與帶電的固定相相結(jié)合。結(jié)合的蛋白質(zhì)可以通過增加緩沖液的離子強(qiáng)度或者調(diào)節(jié)其pH值進(jìn)行洗脫。
IEX的固定相是由惰性瓊脂糖或者高分子基質(zhì)與帶電基團(tuán)共價(jià)結(jié)合組成。介質(zhì)微粒有很多尺寸，可以無孔，也可以有多種不同尺寸的孔。介質(zhì)的選擇主要根據(jù)所需的結(jié)合能力、分辨率和流速要求來決定。介質(zhì)顆粒尺寸越小，分辨率越高，但相應(yīng)的流速也越低，分離時(shí)間也更長(zhǎng)。多孔介質(zhì)比無孔介質(zhì)的結(jié)合能力更強(qiáng)。無孔介質(zhì)中，蛋白質(zhì)不能進(jìn)入樹脂內(nèi)部，因此相比多孔介質(zhì)，前者的樣品回收率更高，分辨率更高，分離時(shí)間也更短。一個(gè)研究表明，對(duì)于大多數(shù)蛋白質(zhì)，采用無孔介質(zhì)和多孔介質(zhì)的分辨率和回收率都類似，但對(duì)于尺寸較大的蛋白質(zhì)，多孔介質(zhì)由于體積排阻效應(yīng)而在分辨率上有一定損失。
IEX中*常用的4種帶電官能團(tuán)如下所示。它們根據(jù)離子交換能力的強(qiáng)弱分類，強(qiáng)離子交換基團(tuán)可離子化的pH范圍比弱離子交換基團(tuán)的范圍更大。
陰離子交換 （固定相帶正電）:1、季銨（Q） - 強(qiáng)陰離子交換基團(tuán)2、二乙氨乙基（DEAE） -弱陰離子交換基團(tuán)
陽離子交換 （固定相帶負(fù)電）:1、磺酸甲酯（S） -強(qiáng)陽離子交換基團(tuán)2、羧甲基（CM） - 弱陽離子交換基團(tuán)
因?yàn)閺?qiáng)離子交換基團(tuán)的活性基團(tuán)在很大的pH范圍內(nèi)均可保持帶電，它可以在蛋白質(zhì)結(jié)合所需pH值是特別強(qiáng)的酸性或堿性的情況下使用（假設(shè)該pH值下蛋白質(zhì)穩(wěn)定性仍得以保持）。有些蛋白質(zhì)在弱離子交換上的保留較弱，使得它們可以用較低的離子強(qiáng)度洗脫 。由于高離子強(qiáng)度會(huì)影響部分蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，而弱離子交換不需要在ji端的pH值條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)合，因此可能對(duì)蛋白質(zhì)更合適。
離子交換色譜的固定相首先用低離子強(qiáng)度的緩沖液平衡，然后將蛋白質(zhì)樣品用和平衡過程相同離子強(qiáng)度的緩沖液上樣到固定相。結(jié)合的蛋白質(zhì)在用更高離子強(qiáng)度或pH值不同（圖6）的緩沖液洗脫前先淋洗一段時(shí)間。洗脫緩沖液中的抗衡離子與帶電的固定相相互作用，取代了柱上的蛋白質(zhì)。在離子交換層析中，某些鹽類代替結(jié)合蛋白和保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的能力，可能比其他種類的鹽可能更有效 。
NaCl或KCl是洗脫液中*常用的鹽類，其中Na+或K+是陽離子交換層析中的抗衡離子，Cl-是陰離子交換層析中的抗衡離子。另一方面，還可以通過調(diào)節(jié)緩沖液的pH值來減少蛋白質(zhì)的電荷并破壞其與固定相之間的相互作用。對(duì)于結(jié)合到陽離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，增加緩沖液pH值會(huì)使蛋白質(zhì)所帶正電荷減少，因此可將其從柱上洗脫下來。對(duì)于結(jié)合到陰離子交換固定相上的蛋白質(zhì)，降低pH值可減少蛋白質(zhì)所帶負(fù)電荷將其從柱上洗脫下來。
同時(shí)，還可以調(diào)節(jié)緩沖液的pH值使目標(biāo)蛋白質(zhì)不與離子交換固定相相結(jié)合，而與此同時(shí)雜蛋白與固定相結(jié)合。如此，可在穿透液中收集目標(biāo)蛋白質(zhì)，而雜蛋白通過與固定相結(jié)合得以去除。
與其他層析方法相比，離子交換層析在確定蛋白質(zhì)結(jié)合、洗脫和獲得足夠高的分辨率的*佳條件時(shí)可能需要解決更多的問題。
凝膠過濾層析
凝膠過濾又稱為分子篩及體積排阻，體積排阻層析是根據(jù)蛋白質(zhì)具有不同的水力學(xué)半徑將它們進(jìn)行分離，該數(shù)據(jù)主要通過測(cè)量分子尺寸和形狀兩方面信息獲得。與上述其他層析過程不同的是，蛋白質(zhì)不與SEC的固定相相結(jié)合，而是依靠它們通過惰性固定相的速度不同來完成分離。
圖 9. 三種不同水力學(xué)半徑的蛋白質(zhì)混合物用體積排阻色譜柱分離。
大蛋白因?yàn)椴荒苓M(jìn)入介質(zhì)孔道內(nèi)部而只能直接流經(jīng)柱體*先流出。稍小的蛋白質(zhì)會(huì)進(jìn)入介質(zhì)孔道內(nèi)部，流經(jīng)的路徑更復(fù)雜，因此需要更多的時(shí)間來穿過介質(zhì)并流出柱體
基于SEC可分辨不同種類蛋白的能力，它通常是一種用于*后一步純化的有效方法。低聚物 、去折疊的蛋白分子和缺失蛋白都可以在逐漸置換緩沖液的過程中與結(jié)構(gòu)完整的天然蛋白質(zhì)分子分離開。通常，由于SEC可使用溶劑種類更多，所用的緩沖鹽也更少，因此比透析的緩沖液置換過程更快也更可靠。整個(gè)SEC過程都只使用一種溶劑，而市購的SEC固定相幾乎與所有常規(guī)的緩沖液兼容。
固定相的類型和柱子的長(zhǎng)度對(duì)蛋白質(zhì)的SEC分離的分辨率有很大的影響。市場(chǎng)上有很多種固定相可選，其選擇*好是根據(jù)待分離蛋白質(zhì)分子的分子量和分離條件兩方面來決定。
與其他層析方法一樣，SEC同樣既有優(yōu)點(diǎn)也有缺點(diǎn)。是否采用SEC要取決于蛋白質(zhì)本身及其后續(xù)應(yīng)用的要求。
SEC的優(yōu)點(diǎn)：1、可進(jìn)行緩沖液交換和脫鹽。2、可分離其他純化技術(shù)難以分離的相似品種（如蛋白片段和低聚物）。3、可與多種溶劑相容。4、不依賴于蛋白質(zhì)的任何一種特殊形式進(jìn)行保留和洗脫。
SEC的缺點(diǎn):1、分離效果嚴(yán)重依賴柱子的填裝效果。2、蛋白質(zhì)與介質(zhì)間有非特異性相互作用，會(huì)降低分辨率。3、對(duì)復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物分辨率低。4、為保證足夠的分辨率，上樣量必須較小。這對(duì)沉淀得到的高濃度蛋白質(zhì)是一個(gè)問題。
要優(yōu)化SEC條件以獲得*好的分離效果，常常需要耗費(fèi)大量時(shí)間，而一些因素會(huì)對(duì)分離效果產(chǎn)生非常大的影響。
提高SEC分離效果的條件:1、上樣體積盡量*小。上樣體積越小，洗脫組分的擴(kuò)散將會(huì)越弱。2、緩沖液中加鹽。少量的鹽有助于防止蛋白質(zhì)與固定相間的非特異性相互作用。這將保證所有的蛋白質(zhì)可以穩(wěn)定地流過整個(gè)層析柱。3、采用合適的流速。流速過快使得小分子沒有足夠的時(shí)間流經(jīng)介質(zhì)孔道，流速過慢則會(huì)導(dǎo)致樣品擴(kuò)散時(shí)間增加。4、保證樣品和溶劑的黏度接近。調(diào)整樣品的條件使其與洗脫緩沖液的類似。5、調(diào)整層析柱長(zhǎng)度。柱子過短使蛋白質(zhì)分離不充分。而柱子過長(zhǎng)則使得蛋白質(zhì)樣品擴(kuò)散嚴(yán)重。6、重裝柱子。柱子的填裝效果會(huì)蛋白質(zhì)的分離效果有相當(dāng)大的影響。如果介質(zhì)顆粒沒有分布均勻或者填裝時(shí)帶入氣泡，蛋白質(zhì)將不能順利地流過固定相。此外，如果柱子跑干了，就必須重裝。柱子填裝不好通常就是分離效果不好的原因。
由于SEC并不是基于蛋白質(zhì)官能團(tuán)間的相互作用來進(jìn)行分離，所有的蛋白質(zhì)都在相同的條件下進(jìn)行洗脫，所以分離效果僅僅依賴于蛋白質(zhì)各自不同的水力學(xué)半徑。因此，SEC通常不適合在含有較多雜蛋白的純化工藝前期使用。但是，SEC又可作為一種快速可靠的樣品脫鹽或者小分子去除方法用于分離工藝前或中期。在純化的*后階段，當(dāng)只剩痕量雜蛋白時(shí)，SEC則是一種蛋白質(zhì)分離和置換保存緩沖液的有效方法。
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