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蛋白質(zhì)技術(shù)專題:蛋白等電聚焦凝膠電泳技術(shù)(二)
  • 發(fā)布日期:2019-02-27     信息來源:      瀏覽次數(shù):2279
    • 8.常見問題及解釋
      1) 若產(chǎn)生模糊條帶則證明聚焦不*,這可能是由于電泳中的問題或大分子蛋白質(zhì)限制了其在凝膠中的遷移能力。若聚焦時間過長或過短,條帶的分辨率會下降。增加電壓梯度可以使帶形更加銳利。高分子量蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠中可以聚焦的更好。
      2) 產(chǎn)生歪斜的條帶通常由于不正確的pH梯度,檢查電極是否潔凈,是否同凝膠鏈接良好,同時應(yīng)該注意凝膠的邊緣效應(yīng)。
      3) 蛋白帶的紋理現(xiàn)象是等電聚焦中經(jīng)常遇到的問題,可能是一下原因:
      a,蛋白質(zhì)聚集或沉淀(尤其在等電點附近),或上樣量過大,8M尿素通常用來防止蛋白質(zhì)聚集,去垢劑Triton X-100和NP-40常用來防止膜蛋白的聚集,所以上樣前一定要離心以除去不溶解的顆粒;
      b,樣品中殘存核酸,可以采用多種方法去除核酸污染,如酸抽提、鹽沉淀、核酸酶消化等;
      c,蛋白質(zhì)修飾,非超純級的尿素中的異氰酸鹽污染物可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)的氨甲?;?,預(yù)電泳可以去除異氰酸鹽,蛋白質(zhì)樣品處理或儲存不當(dāng)會發(fā)生包括Cys殘基氧化,Asn或Gln殘基去氨基化等修飾過程;
      d,波浪形條帶常由于樣品中鹽濃度過高,有時候載體兩性電解質(zhì)或電極液不純或電極不潔凈也會產(chǎn)生波浪形條帶;
      e,電極同凝膠連接不平行,配置凝膠時候試劑不純,載體兩性電解質(zhì)濃度過低可導(dǎo)致不均等的pH梯度,若凝膠堿性部分pH梯度丟失,其可能原因是陽極飄移,可以補(bǔ)充pH9-11的載體兩性電解質(zhì)或進(jìn)行非平衡pH梯度電泳;
      f,蛋白質(zhì)條帶丟失或過淡可能由于蛋白質(zhì)分子量較低(<10kDa>或蛋白質(zhì)在固定中未被變性,增加三***濃度或使用戊二醛固定即可;
      h,復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物等電聚焦后可以產(chǎn)生相互重疊的斑點,改變等電聚焦凝膠pH范圍可以解決此問題。進(jìn)一步的蛋白質(zhì)純化或沉淀處理可以避免重疊斑點的產(chǎn)生。

      9.其他要注意的事項

      1)等電聚焦后可用一根染色的細(xì)線(0.1mm)標(biāo)出染料前沿的位置;
      2)不同品牌的載體兩性電解質(zhì)性質(zhì)上有細(xì)微的差別,使用不同來源的載體兩性電解質(zhì)凝膠時候蛋白質(zhì)分離樣式略有差異,若要獲得好的重復(fù)性一般不要更換載體兩性電解質(zhì)的品牌;
      3)通常,窄范圍的pH梯度可以提高分辨率,但是需要時間也比較常,pH梯度范圍為2是較好的選擇;
      4)由于電源和凝膠冷卻系統(tǒng)的限制,長的凝膠長度為8-10cm,實際上,分別電泳幾塊不同的pH梯度的凝膠比只電泳一塊較長凝膠效果更好;
      5)當(dāng)?shù)入娋劢闺娪緯r間很長時候(>3000V·h),由于載體兩性電解質(zhì)不穩(wěn)定造成的陰極漂移將成為嚴(yán)重問題,陰極漂移會破壞pH梯度,尤其是pH8以上的梯度,為了克服此問題,開發(fā)了一種較短時間(1600V·h)完成等電聚焦電泳的技術(shù),即非平衡pH梯度電泳,這樣可以在高pH范圍內(nèi)聚焦蛋白質(zhì),但該方法不能用來測定蛋白質(zhì)等電點。
      6)尿素可以促進(jìn)蛋白質(zhì)溶解,并消除蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)-脂類相互作用,可增加聚焦速度和提高分辨率,同時抑制陰極漂移,但是也要注意變性蛋白質(zhì)的等電點可能同天然蛋白有所差異。
      7)若蛋白溶液中含有SDS,可加入尿素至終濃度8M,在高濃度的尿素下,SDS同蛋白質(zhì)的相互作用極小。
      8)在變性液中加入2%Triton X-100以保證蛋白質(zhì)(尤其是膜蛋白)的充分溶解,有些作者推薦使用如CHAPS和Zwittergent3-14等兩性離子去垢劑;
      9)超薄凝膠(50-500um)比常用標(biāo)準(zhǔn)等電聚焦更有優(yōu)勢,因為高電場強(qiáng)度和更佳的冷卻效果使聚焦速度更快,分辨率更高。
      10)在聚丙烯酰胺等電聚焦凝膠中,高分子量蛋白質(zhì)(>750kd)常常表現(xiàn)異常的遷移行為,瓊脂糖凝膠或瓊脂糖-丙稀酰胺凝膠較適用于高分子量蛋白質(zhì)。

      11) 考馬斯亮藍(lán)染色中,三***固定后用0.25%SDS的乙醇:醋酸:水(33:10:57)溶液洗滌凝膠10-30min可以進(jìn)一步改善染色效果。SDS同載體兩性電解質(zhì)結(jié)合后可以更好的去除載體兩性電解質(zhì)。
      10.固相pH梯度等電聚焦電泳

      簡介:固相pH梯度等電聚焦是80年代建立起來的一種等電聚焦技術(shù),其所用的介質(zhì)是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙稀酰胺衍生物,它們于丙稀酰胺和甲叉雙丙稀酰胺有相似的聚合行為。固定化電解質(zhì)一端的雙鍵可以在聚合**價結(jié)合到聚丙烯酰胺介質(zhì)中,其另一端的R集團(tuán)為弱酸或弱堿,可在聚合物中形成弱酸或弱堿的緩沖體系,利用緩沖體系滴定終點附近一段pH范圍就可行成近似線性的pH梯度,所以固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子,在凝膠聚合時候便形成pH梯度,不隨環(huán)境電場條件的改變而改變,后者是兩性分子,在電場中遷移到自己的等電點后才形成pH梯度。固相pH梯度等電聚焦比傳統(tǒng)等電聚焦具有更高的分辨率,更大的上樣量,其分辨率可達(dá)到0.001pH,是目前分辨率高的電泳方法之一。